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關(guān)鍵詞:醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué);教學(xué)模式;教學(xué)改革
醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)是一門以細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，探索研究人體細胞發(fā)生、發(fā)育、增殖、衰老、死亡以及細胞結(jié)構(gòu)與功能的異常與人類疾病關(guān)系的學(xué)科［1］。醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)是臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)、口腔醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)等醫(yī)學(xué)專業(yè)的一重要基礎(chǔ)課，同時也是生理學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、組織胚胎學(xué)、藥理學(xué)等醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程以及后續(xù)臨床課程的基礎(chǔ)［2］。學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的基本理論知識有助于醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生從分子細胞層面理解人體生命活動規(guī)律和疾病發(fā)生發(fā)展進程，為專業(yè)課學(xué)習(xí)和后續(xù)的科研工作奠定堅實的理論基礎(chǔ)［3］。醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)是一門實驗操作性極強的學(xué)科，實驗教學(xué)是這門課程教學(xué)工作中的重要實踐環(huán)節(jié)，在培養(yǎng)學(xué)生動手能力、實踐探索能力和科學(xué)創(chuàng)新能力等方面具有重要作用［4-6］。傳統(tǒng)的教學(xué)理念和教學(xué)方法已經(jīng)不能滿足新時代的需要，如何能在有限的時間內(nèi)，讓學(xué)生系統(tǒng)掌握醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的基礎(chǔ)理論知識，并熟練掌握基本實驗操作技術(shù)，是新形勢下醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)教學(xué)改革的一項重要內(nèi)容［7-8］。本文結(jié)合鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的實際情況，對醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)理論課及實驗課教學(xué)中存在的問題及改革策略進行探討并提出建議，以提高醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)教學(xué)質(zhì)量。
1提高醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)理論課教學(xué)質(zhì)量的建議
1．1理論課教學(xué)內(nèi)容的改革
首先，針對不同專業(yè)，因材施教。臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、臨床藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)等專業(yè)均需要開設(shè)醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)。任課教師應(yīng)該結(jié)合教學(xué)大綱并根據(jù)教材內(nèi)容，為不同專業(yè)的學(xué)生制定相應(yīng)的教學(xué)計劃和授課內(nèi)容，按照學(xué)校的課程設(shè)置，多方面、多角度、多層次因材施教，提高醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的課堂教學(xué)效果。其次，注重基礎(chǔ)理論，由淺入深。注重教學(xué)內(nèi)容的基礎(chǔ)性，構(gòu)建并完善由細胞基本結(jié)構(gòu)及其功能、細胞重大生命活動現(xiàn)象及本質(zhì)等所組成的理論教學(xué)體系，加強學(xué)生對基本理論知識及基礎(chǔ)實驗技術(shù)的理解。授課教師應(yīng)該以真核細胞的結(jié)構(gòu)與功能為教學(xué)重點，使學(xué)生對細胞的主要結(jié)構(gòu)及其功能等有系統(tǒng)、全面的了解和認識。然后，精煉教材內(nèi)容，突出重點。醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)課程的內(nèi)容較多，但課時有限，所以，任課教師應(yīng)精煉教材內(nèi)容，有的放矢授課。該門課程的必修內(nèi)容是認識人類自身生命活動的基礎(chǔ)，也是認識疾病發(fā)生、發(fā)展的理論基礎(chǔ)。授課教師在授課過程中要注意精練授課內(nèi)容，突出重點章節(jié)，同時，課后需要對本節(jié)課的內(nèi)容進行歸納總結(jié)。
1．2理論課教學(xué)方法的改革
首先，使用啟發(fā)式教學(xué)。授課教師應(yīng)該在課堂上開展啟發(fā)式教學(xué)，實現(xiàn)教師與學(xué)生的課堂互動。啟發(fā)式教學(xué)相比傳統(tǒng)單純由教師講課的教學(xué)方式更具有優(yōu)勢，可以更加有效地激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。啟發(fā)式教學(xué)不但注重知識的傳授，更注重能力培養(yǎng)，因此，啟發(fā)式教學(xué)可提高學(xué)生的思維能力和創(chuàng)新能力。其次，使用多媒體教學(xué)。醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)課程中有很多細胞結(jié)構(gòu)圖和分子機制圖需要制作成動畫，以使復(fù)雜抽象的內(nèi)容變得直觀有趣，調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性，增強學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。同時，任課教師可以充分利用網(wǎng)絡(luò)資源，搜集醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的視頻課件資料并運用到課堂教學(xué)中。這樣既可以拓展學(xué)生的學(xué)術(shù)視野，又可以提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。然后，使用案例式教學(xué)。案例教學(xué)是在事實案例基礎(chǔ)上的一種開放式、互動式的新型教學(xué)方式。醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生不僅要掌握細胞的結(jié)構(gòu)、功能，還應(yīng)該熟悉細胞的病理改變與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。但是由于醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)課程的理論性強、內(nèi)容抽象，所以任課教師應(yīng)該積極探索案例式教學(xué)，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的教學(xué)質(zhì)量。
1．3理論課考試方式的改革建議
首先，優(yōu)化考試內(nèi)容。任課教師可以通過以下幾點優(yōu)化理論課程的考試內(nèi)容:(1)建立和完善理論課程的考試題庫，保證理論課程考試的有效性;(2)根據(jù)本院開設(shè)的臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)等專業(yè)設(shè)置相對應(yīng)的考試題目;(3)指導(dǎo)學(xué)生撰寫綜述性論文或科研標書，以培養(yǎng)醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生良好的思維能力和創(chuàng)新意識。其次，優(yōu)化考試形式。任課教師可以通過以下方法優(yōu)化理論課程的考試方式:(1)構(gòu)建綜合豐富的考試方式。建立平時成績和期末考試成績相結(jié)合的考試體系;(2)增加創(chuàng)新能力考試的比重。任課教師讓學(xué)生按照要求寫出科研標書并進行打分;(3)增加平時表現(xiàn)考試的比重。平時表現(xiàn)考試主要是在課堂上對學(xué)生回答問題的情況予以評分并記錄。然后，優(yōu)化評價方案。任課教師可以通過調(diào)整期末閉卷考試及平時表現(xiàn)考試優(yōu)化評價方案。理論課考試中的期末閉卷考試成績占理論課總成績的70%，試題從考試題庫中隨機抽取。同時理論課考試中也包含學(xué)生的平時成績，這一部分占總成績的30%，包括學(xué)生的出勤情況、課堂上回答問題的情況以及學(xué)生完成綜述性論文的情況。
2提高醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗課教學(xué)質(zhì)量的建議
2．1實驗課教學(xué)內(nèi)容的改革建議
首先，優(yōu)化實驗教學(xué)大綱。由于受到課堂學(xué)時及硬件條件等方面的制約，很多院校的醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)課程的實驗課內(nèi)容僅僅局限在一些驗證性和基礎(chǔ)性的實驗。任課教師需要調(diào)整教學(xué)內(nèi)容，增開一些與理論課程密切相關(guān)并且與學(xué)科前沿緊密聯(lián)系的綜合設(shè)計實驗。這樣可以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，更好地發(fā)揮學(xué)生的積極性和主觀能動性。其次，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力。任課教師可以在基礎(chǔ)性實驗之外開設(shè)一些探索性及創(chuàng)新性較強的綜合實驗，例如細胞融合實驗、細胞凋亡實驗、細胞免疫組織化學(xué)實驗和免疫熒光實驗等。培養(yǎng)并提高學(xué)生的實際操作能力以及分析問題和解決問題的能力，使學(xué)生初步具備進行設(shè)計性實驗的能力，提高學(xué)生的科研素質(zhì)和創(chuàng)新能力。然后，設(shè)置開創(chuàng)綜合實驗。任課教師應(yīng)當結(jié)合理論課內(nèi)容及相關(guān)臨床應(yīng)用，修改完善實驗課教學(xué)大綱，科學(xué)設(shè)置實驗內(nèi)容，培養(yǎng)學(xué)生的實驗操作能力，以增強學(xué)生的科研興趣為重點，在實驗課教學(xué)中適當增加一些開放性強且創(chuàng)新性強的綜合實驗，讓學(xué)生運用已掌握的知識與技術(shù)進行更深入的研究設(shè)想，培養(yǎng)獨立科研工作的能力。
2．2實驗課教學(xué)方法的改革建議
首先，應(yīng)用啟發(fā)式教學(xué)。與傳統(tǒng)的實驗課教學(xué)相比，在啟發(fā)式的實驗課教學(xué)中，任課教師應(yīng)該在講解實驗?zāi)康暮驮砗螅膭顚W(xué)生根據(jù)所學(xué)的知識設(shè)計實驗過程，然后分析研究最后得到的實驗結(jié)果以探索實驗原理。采用啟發(fā)式教學(xué)可以培養(yǎng)學(xué)生的思維能力，引導(dǎo)學(xué)生積極思考，啟發(fā)學(xué)生從不同的角度考慮問題，期提高學(xué)生的綜合科研素質(zhì)。其次，使用多媒體教學(xué)。在醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的實驗課教學(xué)中，多媒體技術(shù)的應(yīng)用能夠極大地方便課堂教學(xué)工作。多媒體教學(xué)形象生動、易于理解，可以方便地解決一些不容易講解或者難以開展的實驗。另外對于某些受條件所限而不便親自操作的實驗，學(xué)生可以觀看教學(xué)演示片，全面了解這些前沿實驗儀器的結(jié)構(gòu)、性能和用途。然后，開展研究型教學(xué)。醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的實驗課程與科研工作相結(jié)合可以提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和科研熱情。任課教師在實驗課堂上采用開放式的研究型教學(xué)可以激發(fā)學(xué)生的求知欲，讓學(xué)生學(xué)會分析問題和解決問題。開放式研究型的實驗課教學(xué)，讓學(xué)生經(jīng)歷嚴格的科研訓(xùn)練，為以后申報、參與以及實施各種創(chuàng)新性科研項目奠定基礎(chǔ)。
2．3實驗課考試方式的改革建議
首先，優(yōu)化考試內(nèi)容。為全面、科學(xué)地考察學(xué)生的實際動手能力以及科研創(chuàng)新能力，改革后的醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗課的考試內(nèi)容應(yīng)該以核學(xué)生的實驗操作水平為主，以考試學(xué)生的理論知識水平為輔。這種改革模式，可以培養(yǎng)學(xué)生在實驗操作過程中分析問題、解決問題的能力，并拓寬學(xué)生對實驗操作技術(shù)在臨床應(yīng)用中的思考。其次，優(yōu)化考試形式。建立完善的成績評定體系是保證實驗教學(xué)質(zhì)量的關(guān)鍵。實驗課程的考試應(yīng)是一個全方位、多角度、全時段的綜合評測，包括平時課堂考試及綜合實驗考試，平時課堂考試包括出勤情況、課堂回答問題情況和實驗操作情況、實驗報告完成情況，綜合實驗考試包括實驗理論考試、實驗操作考試、開放性及探索性實驗考試等。然后，優(yōu)化評價方案。實驗課的考察應(yīng)該以考察學(xué)生運用實驗技術(shù)的能力為主，包括以下幾點:(1)考察學(xué)生的平時成績，包括出勤情況、實驗報告完成情況等，占實驗課總成績的20%;(2)考查學(xué)生的理論水平，包括實驗基本原理、實驗技術(shù)手段、實驗操作方法等，占實驗課總成績的20%;(3)考察學(xué)生的實驗操作，占實驗課總成績的60%。綜上所述，醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的教學(xué)是教師與學(xué)生共同學(xué)習(xí)、教學(xué)相長的過程。在這個過程中，首先任課教師需要不斷提高自身素質(zhì)，認真做好科研工作并積極學(xué)習(xí)本課程最先進的理論知識與最前沿的實驗技術(shù)。其次，任課教師也需要精心把握課程內(nèi)容，不斷總結(jié)教學(xué)經(jīng)驗，比較各種教學(xué)方法的優(yōu)劣，并將各種教學(xué)方法有機結(jié)合、交叉運用。同時，任課教師可以根據(jù)學(xué)生的不同專業(yè)方向，改進傳統(tǒng)教學(xué)模式中教案和課件的內(nèi)容，在上課時適量引入案例教學(xué)，從而調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。另外，任課教師也需要加強實驗課教學(xué)的比重，改革實驗教學(xué)內(nèi)容，完善實驗教學(xué)條件，采用多種教學(xué)手段，建立完善評價體系，并不斷探索研究新實驗，使實驗課堂更富有學(xué)術(shù)氣氛。以上這些舉措是提高醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)適應(yīng)現(xiàn)代社會發(fā)展的具有較強的綜合能力和科研素質(zhì)，具有獨立發(fā)現(xiàn)問題、思考問題、分析問題及解決問題能力的創(chuàng)新型醫(yī)學(xué)專業(yè)人才。
作者:鄭皓 單位:鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與細胞生物學(xué)系
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RT-PCR檢測耐藥相關(guān)基因MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA的表達取對數(shù)生長期細胞，TRIzol試劑提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，SYBYGreen方法進行實時熒光定量PCR實驗。引物設(shè)計由Invitrogen公司合成，見表1。PCR反應(yīng)體系：cDNA1μl，2×SYBRGreenPCRMastermix12μl，引物F/R（上下游引物的終濃度各為15pmol/μl）各0.3μl，DEPC水11.4μl，共25μl。PCR循環(huán)設(shè)置：50℃2min95℃10min（95℃15s60℃1min）×40個循環(huán)（生成擴增曲線）95℃15s60℃15s95℃15s（生成溶解曲線）。SDS2.2軟件分析處理數(shù)據(jù)，管家基因校正目的基因的表達，得到相對定量結(jié)果。1.6耐藥細胞的保存耐藥細胞SKOV3/TAX30分別凍存于含0、10、30nmol/L紫杉醇藥物的凍存液里。于凍存后1、3、6月分別復(fù)蘇細胞，觀察復(fù)蘇情況，MTT法檢測IC50。1.7統(tǒng)計學(xué)方法對有關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行獨立樣本t檢驗（independentsamplet-test）、單因素方差分析（OnewayANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2、結(jié)果
2.1耐藥細胞的建立
SKOV3經(jīng)300μg/ml大劑量的紫杉醇作用2h后,大部分細胞死亡漂浮，剩余細胞腫脹，伸出樹枝狀突起呈蜘蛛狀，胞質(zhì)見空泡形成、顆粒增多。少量存活的細胞克隆生長，恢復(fù)生長至對數(shù)期消化傳代，再進行下一次沖擊；SKOV3經(jīng)10~30nmol/L小劑量的紫杉醇作用24h，約50%的細胞死亡，細胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，貼壁性變?nèi)?，給藥24~72h內(nèi)最明顯，96~120h后逐漸恢復(fù)原狀。經(jīng)兩種誘導(dǎo)方法獲得的耐藥細胞系，分別命名為SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30。
2.2耐藥細胞的生物特性
2.2.1耐藥指數(shù)MTT實驗結(jié)果顯示，耐藥細胞及其敏感細胞的IC50值及耐藥指數(shù)，可見小劑量濃度遞增誘導(dǎo)的耐藥細胞SKOV3/TAX30耐藥性較強，見表2。2.2.2平板克隆形成實驗在無藥物作用時，SKOV3敏感細胞較兩種耐藥細胞系的克隆形成能力強，見圖1A的d組，SKOV3敏感細胞的克隆形成數(shù)為（934±16.37），SKOV3/TAX300的克隆形成數(shù)為（440±13.75）,SKOV3/TAX30的克隆形成數(shù)為（579±9.50）。與敏感細胞SKOV3相比，兩種耐藥細胞克隆形成數(shù)少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均=0.000），見圖1B。而在相同濃度紫杉醇作用下，耐藥細胞形成的克隆明顯多于敏感細胞。在紫杉醇濃度為5nM時，SKOV3/TAX30可形成（1206±9.50）個克隆，SKOV3/TAX300可形成（870±32.30）個克隆，而SKOV3形成的克隆數(shù)僅（202±6.08），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均=0.000）；當紫杉醇濃度進一步升高為50nM和500nM時，SKOV3/TAX30和SKOV3/TAX300形成的克隆數(shù)仍明顯高于敏感細胞SKOV3。紫杉醇濃度為50nM時，SKOV3細胞與SKOV3/TAX300細胞形成的克隆數(shù)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.013）,SKOV3細胞與SKOV3/TAX30細胞形成的克隆數(shù)相比，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；紫杉醇濃度為500nmol/L時，SKOV3細胞與SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞形成的克隆數(shù)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.009、0.0001），見圖1B。2.2.3生長曲線倍增時間的差異SKOV3敏感細胞和兩種耐藥細胞系在相同條件下培養(yǎng)7天，細胞增殖產(chǎn)生一定的差異。耐藥細胞的生長較敏感細胞減慢，生長曲線的斜率減小，見圖2。同時，根據(jù)生長曲線計算出SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞的倍增時間分別為28.90h、24.0h，與敏感細胞的倍增時間20.84h相比也有所延長。
2.3耐藥相關(guān)基因
MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA在各細胞中的表達MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCAmRNA在SKOV3、SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞中的相對表達豐度見圖3A、3B。兩種耐藥細胞中，MDR1的表達明顯增高，提示SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30對紫杉醇的耐藥與MDR1高表達有關(guān)。SKOV3/TAX300細胞中PRKCA、LRP的表達均高于SKOV3細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016，P=0.005），BCL2L1的表達與敏感細胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.815）。而SKOV3/TAX30細胞的PRKCA、LRP的表達與敏感細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.154，P=0.206）。BCL2L1的表達低于敏感細胞（P=0.001），見圖3B。以上數(shù)據(jù)表明不同誘導(dǎo)方式導(dǎo)致耐藥細胞發(fā)生不同生物學(xué)變化，可能存在不同的耐藥機制。
2.4耐藥細胞的保存
耐藥細胞SKOV3/TAX30分別凍存在含有0、10、30nM紫杉醇的凍存液中，于凍存后1、3、6月復(fù)蘇，檢測IC50，見表3。1、3月后檢測結(jié)果提示，在3種藥物濃度條件下的細胞IC50沒有明顯區(qū)別，但凍存6月后，無藥凍存組的耐藥細胞與兩種加藥凍存組的細胞比較，其IC50明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同一個藥物濃度條件下，無藥凍存組的耐藥細胞在凍存6月時，出現(xiàn)耐藥性下降，而兩種加藥凍存組細胞在6月的凍存過程中，細胞IC50雖然出現(xiàn)輕度下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
3、討論
3.1耐藥細胞的建立
本實驗結(jié)果提示：增加給藥劑量、適當延長無藥間歇期，可能延緩細胞的耐藥性。由于大劑量沖擊誘導(dǎo)與臨床治療模式相似，臨床上體內(nèi)耐藥指數(shù)≥2倍即足以導(dǎo)致化療失敗[5]，因此大劑量沖擊誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥細胞雖然耐藥指數(shù)較低，也是模擬臨床耐藥的良好模型。
3.2耐藥細胞的特性
本研究的結(jié)果表明：在無藥物作用時，SKOV3細胞的集落形成能力強于兩種耐藥細胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30，但在不同濃度紫杉醇藥物條件下，耐藥性最強的SKOV3/TAX30集落形成能力也最強，而敏感細胞SKOV3的集落形成能力最弱，此結(jié)果與MTT法檢測的耐藥性一致。紫杉醇的作用機制是促進微管蛋白二聚體裝配成微管，抑制紡錘體形成，將細胞阻斷于G2/M期，細胞的有絲分裂異?；蛲Ｖ?，使多核細胞的形成增多[6]。誘導(dǎo)的過程中耐藥細胞膨脹、形態(tài)不規(guī)則、細胞體積的增大可能與細胞群體中多核細胞的增多有關(guān)。本研究的生長曲線實驗中，SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30的倍增時間分別為28.9、24.0h，與敏感細胞SKOV3的倍增時間20.84h相比有明顯延長，顯示耐紫杉醇的卵巢癌細胞生長速度減慢。細胞周期的阻滯，除導(dǎo)致一些細胞周期特異性藥物失效外，腫瘤細胞處于相對靜止狀態(tài)，易對化療藥物產(chǎn)生耐受。
3.3耐藥相關(guān)基因的檢測
卵巢癌紫杉醇耐藥機制的研究中，多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）一直是熱點。多藥耐藥是指對一種藥物具有耐藥性的同時，也對其他結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐受的一種現(xiàn)象。多藥耐藥的產(chǎn)生是一個多因素的過程，主要包括：（1）細胞內(nèi)有效藥物濃度的降低；（2）細胞內(nèi)藥物活性的改變；（3）凋亡的抑制；（4）腫瘤細胞微環(huán)境改變化療敏感度。P-gp是多藥耐藥基因MDR1編碼的相對分子質(zhì)量為17kD的一種跨膜糖蛋白，其功能是使細胞內(nèi)藥物濃度降低，藥物的作用減弱或喪失，細胞由此獲得耐藥性。與大多數(shù)其他化療藥物的多藥耐藥機制相似，紫杉醇作為P-gp的作用底物之一，其耐藥機制與MDR1基因擴增導(dǎo)致的P-gP高表達密切相關(guān)[7-8]。肺耐藥相關(guān)蛋白LRP是在多藥耐藥的肺癌細胞株中發(fā)現(xiàn)的與MDR相關(guān)的非糖蛋白，相對分子質(zhì)量為110kD，能阻止藥物通過核孔進入細胞核，避免其作用于核內(nèi)靶點，藥物運送到胞質(zhì)的囊泡中，再通過胞吐作用將藥物排出體外，從而發(fā)生紫杉類藥物耐藥[9-10]。凋亡抑制基因也參于紫杉醇耐藥。BCL2L1基因，全稱為BCL-2樣1基因（BCL-2-like1）,編碼蛋白屬于BCL-2蛋白家族，BCL-2蛋白家族通過抑制腫瘤細胞凋亡，導(dǎo)致耐藥性[11-12]。PRKCA基因為蛋白激酶Cα（proteinkinaseCalpha），也被稱為PKCA、PRKACA、KPCA、AAG6。細胞過度增殖和抗細胞凋亡機制障礙都可導(dǎo)致腫瘤進展和耐藥現(xiàn)象發(fā)生[13]。另外PKC的作用是使底物蛋白磷酸化而活化，p-gp是PKC的作用底物，當其表達增加或活性增強時，可使大量的P-gp磷酸化而活化，從而產(chǎn)生耐藥性。本研究結(jié)果提示。SKOV3/TAX300細胞PRKCA、LRP的表達均略高于敏感細胞。但SKOV3/TAX30細胞的PRKCA、LRP的表達與敏感細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。BCL2L1在SKOV3/TAX30細胞的表達低于敏感細胞，但SKOV3/TAX300細胞中BCL2L1的表達略高于敏感細胞，結(jié)果提示不同方式誘導(dǎo)的耐藥細胞，可能存在不同的耐藥機制。
3.4耐藥細胞的保存
1．1組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSCs臍帶取自正常分娩的新生兒(征得其父母同意)。首先用含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗臍帶3次，去除雜物;用無菌的手術(shù)剪刀將臍帶剪成3～4cm的節(jié)段，再沿長度方向剪開，以暴露臍帶膠質(zhì)部分，去除血管;置于含雙抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成約0．5cm3的組織塊，以膠質(zhì)部分貼于基底平鋪于24孔板中，每孔2～3塊，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育1～2h;待組織塊自然粘附于皿底部后加入含雙抗、FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)基，待觀察到有小三角形或梭形細胞從組織中鋪展出時，取出組織塊。整個分離過程注意無菌操作。待細胞生長至70%～80%匯合時，即可傳代。利用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取第5代細胞，采用細胞免疫熒光技術(shù)鑒定hUC-MSCs的表面標記物CD44。
1．2肝細胞標志基因的檢測按照總RNA提取試劑盒的操作說明分別提取hUC-MSCs和人肝癌細胞HepG2的總RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因組，最后檢測RNA的濃度和純度，立即進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA或保存于－80℃?zhèn)溆谩２捎肞rime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根據(jù)GenBank提供的人肝細胞標志基因序列，使用PrimerPremier5．0軟件設(shè)計引物，引物序列和產(chǎn)物大小見表1。GAPDH為內(nèi)參對照。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30個循環(huán);最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用20g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠分析系統(tǒng)下拍照。
1．3PAS糖原染色按照PAS染色試劑盒的說明書操作，對第5代hUC-MSCs和HepG2進行糖原染色，在倒置相差顯微鏡下觀察并照相。
2結(jié)果
2．1hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定組織塊貼壁培養(yǎng)3～4d時，可觀察到組織塊間隙鋪展出小三角形或長梭形的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至7d左右，可觀察到局部細胞呈集落生長，此時，在無菌條件下取出組織塊，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，細胞可達80%～90%匯合，即可傳代。用胰酶/EDTA消化后細胞呈亮而圓的單個分散狀，以1∶3的比例進行傳代，約4h貼壁，2d后迅速生長。倒置相差顯微鏡下可觀察到細胞較大，輪廓清楚，內(nèi)部有清晰的應(yīng)力纖維，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯，呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)(圖1A);持續(xù)培養(yǎng)大約2周時，細胞基本達到完全匯合，形態(tài)發(fā)生一定的變化，胞質(zhì)變得狹窄，內(nèi)部的應(yīng)力纖維也不明顯，呈平行排列或漩渦生長(圖1B)。連續(xù)多次傳代，細胞保持穩(wěn)定的、相對均一的成纖維細胞樣形態(tài)以及較強的增殖能力。經(jīng)鑒定分離培養(yǎng)的細胞CD44呈陽性表達，且具有良好的均質(zhì)性。
2．2肝細胞標志基因的表達以HepG2作為陽性對照，用RT-PCR檢測hUC-MSCs的肝細胞標志基因的表達情況，結(jié)果見圖2，hUC-MSCs表達ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表達TAT。
2．3PAS糖原染色結(jié)果對hUC-MSCs和HepG2進行PAS糖原染色，染色結(jié)果顯示兩種細胞的細胞質(zhì)中均有紫色顆粒物形成，即均呈糖原陽性反應(yīng)(圖3)。
3討論
MSCs能分泌多種細胞因子和生長因子，具有直接或間接的抗炎及抗纖維化作用，可抑制肝細胞的死亡和纖維化;還可通過其分泌物抑制肝細胞的凋亡、刺激肝細胞再生、為受損肝細胞提供營養(yǎng)支持等。MSCs還具有低免疫原性及免疫抑制力，適用于進行同種異體移植，在移植后可遷移、歸巢至受損的組織，發(fā)揮治療作用。因此，MSCs在肝臟疾病的細胞移植治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，相較不同來源的MSCs，臍帶來源的MSCs不僅具有干細胞的特性，而且來源豐富、取材方便、增殖能力較強、無倫理法律限制，還具有較低的免疫原性和分化程度，從而成為一個非常有吸引力的移植治療肝病的細胞來源。
作者采用組織塊貼壁培養(yǎng)法從臍帶基質(zhì)中分離獲得hUC-MSCs，與酶消化法和流式細胞儀或免疫磁珠分選法相比，該分離方法操作簡單，消耗低，易于控制。分離培養(yǎng)的hUC-MSCs呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)，具有MSCs的表型特征，均質(zhì)性良好，且在體外長期培養(yǎng)中能保持穩(wěn)定狀態(tài)。進一步的RT-PCR結(jié)果顯示，培養(yǎng)的hUC-MSCs同時表達成熟肝細胞的標志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，而不表達TAT，與Campard等的研究結(jié)果一致，提示hUC-MSCs可能具有肝細胞的一些相關(guān)功能，如合成白蛋白、合成糖原及解毒功能等;PAS糖原染色結(jié)果則證明hUC-MSCs具有糖原合成和儲存能力。
經(jīng)濟的迅猛發(fā)展帶動科技的日新月異，網(wǎng)絡(luò)技術(shù)與通信技術(shù)發(fā)展迅速，微信、微博等交流媒介成為大眾知識共享的傳播平臺，而微課作為教學(xué)中的創(chuàng)新也備受關(guān)注，作為對傳統(tǒng)教學(xué)模式的顛覆，其更注重教學(xué)效率的提升與教學(xué)質(zhì)量的理想化。伴隨移動學(xué)習(xí)時代的到來，微課使得當前學(xué)校教育及社會教育都發(fā)生了顯著的變化。但是我們應(yīng)該看到，時代催生的網(wǎng)絡(luò)視頻也帶有某種弊端性，難以真實有效地滿足各個層面的學(xué)習(xí)需求[1]。焦建利教授提出：傳統(tǒng)的課堂實錄視頻資源已經(jīng)難以實現(xiàn)互聯(lián)網(wǎng)時代人們注意力模式的匹配，因此傳統(tǒng)的教學(xué)方式也很難滿足師生教與學(xué)的需求。
加上網(wǎng)速及寬帶的硬性限制，教學(xué)資源周轉(zhuǎn)率低，優(yōu)秀教育教學(xué)資源被無形浪費?；谶@樣的背景，微課誕生，吸取了傳統(tǒng)教學(xué)視頻的弊端教訓(xùn)，更注重主題的突出明確，更具有針對性與服務(wù)性，在內(nèi)容設(shè)置上也趨于短小精悍，實現(xiàn)了自由補充與延伸[2]。對于生物細胞學(xué)科教學(xué)來說，實驗是教學(xué)的關(guān)鍵，在教學(xué)中發(fā)揮著重要的作用。不可否認的是生物學(xué)作為生命科學(xué)的前沿學(xué)科之一，無論是實驗技術(shù)方法還是理論知識闡述都實現(xiàn)了深度的提升與廣度的延伸，逐漸實現(xiàn)與遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及發(fā)育生物學(xué)的學(xué)科融合，逐漸在生命科學(xué)研究領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)[3]。因此，實現(xiàn)微課與細胞生物學(xué)實驗教學(xué)的結(jié)合，對學(xué)生創(chuàng)新能力與獨立思考能力的培養(yǎng)逐漸成為生物實驗教學(xué)關(guān)注的焦點，成為細胞生物學(xué)實驗教學(xué)改革的要務(wù)。
一、微課簡述
1.微課的起源。微課最早由美國愛荷華大學(xué)LeRoy A. McGrew教授提出，初衷是針對化學(xué)課程總結(jié)的60秒概述，設(shè)置了三大主體部分，分別為總體介紹、解釋說明及舉例分析。后來英國學(xué)者T.P.Kee在此基礎(chǔ)上提出了一分鐘演講，所謂的一分鐘演講就是突出演講的精練傳神，要求具有縝密的邏輯結(jié)構(gòu)及真實生動的案例闡述。在經(jīng)過上述兩個階段的發(fā)展后，微課由美國新墨西哥州圣湖安學(xué)院大衛(wèi).m.彭羅斯提出并創(chuàng)建實施。其包括15到30秒的介紹及結(jié)論，服務(wù)與上文的關(guān)鍵概念導(dǎo)引。然后錄制上述內(nèi)容并限制時間為3分鐘內(nèi)，在微課程指引下提出書面作業(yè)要求，學(xué)會借助課外閱讀或者實踐活動完成關(guān)鍵知識的學(xué)習(xí)。目前最具代表性的當屬Educause的微課理念，不是指微觀學(xué)習(xí)中的微內(nèi)容，而是以建構(gòu)主義學(xué)習(xí)理論為支撐的在線教學(xué)或格式化教學(xué)中的教學(xué)實際。
2.我國微課發(fā)展現(xiàn)狀。我國微課依然是新興事物，起步晚，發(fā)展相對緩慢，目前涉及領(lǐng)域也有部分處于空白?；谖⒄n的發(fā)展現(xiàn)狀，當前學(xué)術(shù)界也未就微課理念達成共識。學(xué)者焦建利[4]認為，微課是對某一知識點的集中闡釋，主要特點就是短小精悍，在線教學(xué)視頻是其主要表現(xiàn)形式。學(xué)者祝智庭[5]則認為微課應(yīng)該就某個教學(xué)主題展開延伸，組織精細化的課堂教學(xué)設(shè)計，時間限度最好控制在10分鐘以內(nèi)。而學(xué)者胡鐵生[6]則認為微課程注重的是視頻的微小，因此在針對單一學(xué)科或者單一知識點組織教學(xué)時應(yīng)注重教學(xué)情景的融入，突出在線學(xué)習(xí)與自由學(xué)習(xí)。這一概念也逐漸被大眾所認可。資源建設(shè)方面，我國微課也尚未成型，目前的應(yīng)用研究還相對零散，評價模式也有待完善。實現(xiàn)微課程的規(guī)范化發(fā)展還有很長的路要走。
二、細胞生物學(xué)實驗教學(xué)存在的問題
1.內(nèi)容更新緩慢，亟待加強。我國的細胞生物學(xué)實驗教學(xué)一直處于教學(xué)滯后階段，僅僅作為理論教學(xué)的補充或者教學(xué)附屬而開設(shè)，缺乏關(guān)注上必然影響教學(xué)的創(chuàng)新與跟進，加上該實驗教學(xué)項目單一化趨勢嚴重，時代氣息不足，技術(shù)手段及知識的綜合運用十分缺乏，內(nèi)容更新十分滯后。
2.教學(xué)方式單一化，學(xué)生自主性不足。細胞生物學(xué)實驗的基本流程就是提前由教師準備好實驗材料、實驗儀器及實驗試劑，學(xué)生在教師的示范引導(dǎo)下按部就班地進行實驗操作，整個操作過程趨于程式化、簡單化。學(xué)生不僅無法在實驗準備階段有所參與，更挫傷了學(xué)生創(chuàng)新與研究的積極性。
3.教學(xué)方法貧乏，缺乏對學(xué)生創(chuàng)新能力培養(yǎng)的關(guān)注。傳統(tǒng)的細胞生物學(xué)實驗教學(xué)受有限的教學(xué)時間的限制，因此實驗內(nèi)容與要求也大多提前限定，教師單純地演示講解，學(xué)生被動地參與學(xué)習(xí)，雙方互動交流不足，教師也無法引導(dǎo)學(xué)生進行實驗的創(chuàng)新。
4.教學(xué)技術(shù)陳舊，現(xiàn)代教育技術(shù)參與較少。細胞生物學(xué)作為生物教學(xué)的前沿學(xué)科，理應(yīng)注重教學(xué)的創(chuàng)新，特別是積極加入現(xiàn)代教育技術(shù)的創(chuàng)新元素，以信息技術(shù)為核心推動實驗教學(xué)。但是我國細胞生物學(xué)的教學(xué)現(xiàn)狀卻是現(xiàn)代教育技術(shù)十分欠缺，傳統(tǒng)實驗教學(xué)維度單一化趨勢嚴重。
三、微課在細胞生物學(xué)實驗中如何應(yīng)用
1.微課的特性和優(yōu)勢，傳統(tǒng)多媒體教學(xué)的弊端：伴隨多媒體技術(shù)的迅猛發(fā)展及教學(xué)融入，部分教師開始嘗試運用多媒體輔助教學(xué)，但是當代大學(xué)生自由散漫的個性也成為多媒體輔助教學(xué)實施的制約因素，學(xué)生難以集中精力聽取教師講課，精品的視頻資源難以得到高效率的運用。應(yīng)用于課后學(xué)習(xí)的視頻資料也難以受到學(xué)生的關(guān)注與重視，多數(shù)處于閑置。微課則突破了視頻教學(xué)的局限，具有普通視頻教學(xué)資源不具備的教學(xué)優(yōu)勢。首先，其教學(xué)內(nèi)容濃縮，教學(xué)時間較短，借助移動端操作更為便捷，學(xué)生學(xué)習(xí)積極性顯著提升。其次，其教學(xué)主題十分明確，學(xué)生能夠迅速找到自己感興趣的點，從而獲得啟發(fā)教育或者延伸學(xué)習(xí)。最后，微課視頻的教學(xué)容量相對較小，符合學(xué)生的接受能力，學(xué)生更積極主動地參與到微課學(xué)習(xí)中去。
2.細胞生物學(xué)微課設(shè)計，把握10分鐘原則：注意力10分鐘。10分鐘內(nèi)有明確的教學(xué)目標，內(nèi)容短小，集中說明一個問題的小課程。微課設(shè)計ADDIE模型：A，分析;D，設(shè)計;D制作;I應(yīng)用;E，評價。通常來說，微課設(shè)計要想保證自身的完整性必須具備6個基本環(huán)節(jié)，分別為教學(xué)主題的明確、前段分析、微課基礎(chǔ)知識點的切割與劃分、微課資源要素的重點設(shè)計、微課視頻錄制及后期加工處理、微課的最終終端輸出與展現(xiàn)。6個環(huán)節(jié)緊緊相扣，推動微課的高效開展。
四、微課引入實驗教學(xué)的意義與應(yīng)用前景
微課具有廣闊的教育應(yīng)用前景。2011年，手機將取代個人電腦成為個人信息中心。學(xué)生自帶設(shè)備BYOD，包括個人電腦、手機、上網(wǎng)本、平板等越來越普遍化。這為微課的實施提供了必備的硬件前提。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，84.44%的被調(diào)查者認可微視頻在微課教學(xué)中的核心地位與作用，并且70%以上的人認為配套的教學(xué)設(shè)計與課件也是不可忽視的部分?？v觀當前的教育改革，多數(shù)一線教師已經(jīng)充分認識到微課教學(xué)的魅力與優(yōu)勢，開始在課堂教學(xué)中嘗試微課教學(xué)。其中范福蘭等人在基于交互式微視頻教學(xué)資源教學(xué)應(yīng)用效果的調(diào)查顯示，70.5%的學(xué)生認為交互式微視頻資源能夠激發(fā)他們對課程學(xué)習(xí)的興趣，單一的圖文及音視頻資源則受關(guān)注度一般，這也從側(cè)面說明隨著流媒體技術(shù)的發(fā)展成熟，微視頻的教學(xué)前景將是廣闊而光明的。
五、一些值得思考的問題
1.有關(guān)微課適用性，微課程在全國范圍內(nèi)展開，帶來教學(xué)思想、教學(xué)模式的重大轉(zhuǎn)變，各個領(lǐng)域、各種培訓(xùn)、不同學(xué)科對于微課程應(yīng)用的嘗試存在“泛用”、“濫用”現(xiàn)象。微課程適用于哪些領(lǐng)域、哪些課程、哪些內(nèi)容以及熒光怎樣設(shè)計、怎樣制作、怎樣使用才是最科學(xué)合理的成為今后科學(xué)研究的新課題。
2.細胞生物學(xué)實驗微課應(yīng)用存在問題，我國針對該專業(yè)的微課理論研究及實踐演練依然不足，多數(shù)高校在微課開展實施的過程中存在建多用少的資源浪費現(xiàn)象。因此必須將微課作為校本研修資源，對其加強引導(dǎo)宣傳，讓教師認可微視頻教學(xué)的優(yōu)勢并拓展專業(yè)發(fā)展的新途徑。此外微課程應(yīng)奠定創(chuàng)新型教學(xué)模式的資源基礎(chǔ)，以期為學(xué)生提供更實用的教學(xué)資源，做好教學(xué)輔助。當然微課作為新興教學(xué)理念，應(yīng)該在移動學(xué)習(xí)與泛在學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上實現(xiàn)教學(xué)需求與教學(xué)實踐的同步發(fā)展，最大限度提升微課程的開展利用率。
六、總結(jié)
微課作為新興的教學(xué)模式理應(yīng)受到關(guān)注，了解微課的本質(zhì)內(nèi)涵，在梳理其優(yōu)勢與缺陷基礎(chǔ)上綜合當前的運用實際，科學(xué)預(yù)測并規(guī)劃后期發(fā)展，實現(xiàn)微課在設(shè)計開發(fā)與應(yīng)用上的創(chuàng)新完善。本文就微課教學(xué)的幾點問題進行了歸納分析，以期為微課教學(xué)的拓展應(yīng)用提供有效思路，讓微課的魅力更多地展現(xiàn)出來，服務(wù)于高校教學(xué)。
1.課程設(shè)置合理化
研究生課程體系的設(shè)置做到適時調(diào)整，豐富選課資源的同時，加強學(xué)生選課的自主性，充分考慮學(xué)生的個性化培養(yǎng)的需求。
2.優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容
創(chuàng)新型人才培養(yǎng)模式改革首要是課程改革，而課程改革首先要解決的問題是教學(xué)內(nèi)容的優(yōu)化。研究生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)應(yīng)該是建立在知識、能力、素質(zhì)的辯證統(tǒng)一的基礎(chǔ)上。知識作為能力和素質(zhì)的載體，是不可或缺的重要一環(huán)，研究生階段知識的獲取不應(yīng)該局限于本科階段的某一本教材的重復(fù)拓展。我們在課堂設(shè)計中集思廣益，打破教材的局限，以學(xué)生興趣為出發(fā)點，設(shè)置了十個小的專題題目，專題內(nèi)容涉及細胞生物學(xué)的基本技術(shù)及其創(chuàng)新、前沿知識、熱點領(lǐng)域，并充分考慮細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的密切關(guān)系。如細胞通訊、細胞信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)及其與疾病的關(guān)系，端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系及其研究進展，細胞骨架與運動和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系舉例（原因分析、分子細胞學(xué)調(diào)整、研究進展）等。學(xué)生既能從中鞏固提煉的基本理論框架，又能獲得豐富的前沿信息，在學(xué)習(xí)中還有助于科研方向的確立和科研思維的培養(yǎng)。
3.改革教學(xué)方法
我們在前幾年的教學(xué)中留心對研究生的理論基礎(chǔ)、能力水平和喜歡的教學(xué)模式做了問卷調(diào)查，相對于本科生研究生階段學(xué)生的特點突出表現(xiàn)為：已經(jīng)具有比較廣泛、系統(tǒng)的理論知識基礎(chǔ)，并具備一定的分析問題的能力，更向往自由的思維和互動表達。綜合研究生的特點和現(xiàn)代教育技術(shù)的發(fā)展，我們在課堂教學(xué)中試行教學(xué)方法改革，徹底改變教師灌輸知識的單一模式，更多地讓學(xué)生自主學(xué)習(xí)，教師擔(dān)負引導(dǎo)、組織實施、總結(jié)和考評的職責(zé)，更多的時候也是討論和爭論的主體之一，變師徒關(guān)系為伙伴關(guān)系。具體實施是依據(jù)學(xué)生興趣分組，3~4人/組，組內(nèi)分工協(xié)作，依據(jù)自己所選的感興趣的專題查閱資料，開展討論并推舉一人以PPT文稿的形式圖文結(jié)合在課堂上匯報講解，同學(xué)可以自由提問，教師做針對性的點評、補充。創(chuàng)新的課堂組織從學(xué)生的興趣出發(fā)保障了自主學(xué)習(xí)的效率，協(xié)作中鍛煉了學(xué)生的團隊意識和合作能力，課堂表達和提問互動有效地活躍了學(xué)習(xí)氣氛，調(diào)動了學(xué)習(xí)的積極性，并提高了學(xué)生綜述及表達能力。此種形式受到了選課學(xué)生的一致好評，也吸引了更多的研究生加入我們的學(xué)習(xí)隊伍中。
4.考評手段合理化
在轉(zhuǎn)變教師單向傳授知識模式的同時，打破以考試分數(shù)作為衡量教育成果的唯一標準的劃一呆板的考評制度。對學(xué)生學(xué)習(xí)的評價主要是課堂表現(xiàn)和實踐實訓(xùn)，各占50%。課堂表現(xiàn)的評價中以小組匯報講解中的綜合能力表現(xiàn)作為主要的考評指標，并逐步完善了評分標準，簡介如下：基本原理簡明扼要、切中要點、通俗易懂；研究應(yīng)用舉例典型、兼顧多方面；重視結(jié)果分析（盡量使用圖表）；重視技術(shù)發(fā)展的進展和研究理論進展（突出新意）。除了陳述者有獎勵分之外，課堂提問及回答者都有酌情加分，極大地調(diào)動了學(xué)生的積極性。學(xué)生課前準備、課堂提問、課后總結(jié)的學(xué)習(xí)資料都可以組織建立個人學(xué)習(xí)檔案，學(xué)習(xí)檔案也可作為酌情加分的因素。
二、反饋與思考
教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法及新的考評方法改革的突出優(yōu)勢在于愛護和培養(yǎng)學(xué)生的好奇心、求知欲，幫助學(xué)生自主學(xué)習(xí)，獨立思考，保護學(xué)生的探索精神、創(chuàng)新思維，營造崇尚真知、追求真理的氛圍，為學(xué)生的稟賦和潛能的充分開發(fā)創(chuàng)造一種寬松的環(huán)境。讓學(xué)生感受、理解知識產(chǎn)生和發(fā)展的過程，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)精神和創(chuàng)新思維，重視培養(yǎng)學(xué)生收集處理信息的能力，獲取新知識的能力，分析問題和解決問題的能力，語言文字表達以及團結(jié)協(xié)作能力。但在試行新的教學(xué)方法的同時，我們也發(fā)現(xiàn)了一些有待于改進的問題。在課程體系的設(shè)置中需要合理調(diào)研，依據(jù)社會、培養(yǎng)目標和學(xué)生主體的需求做出調(diào)整，充分適應(yīng)多學(xué)科交叉融合的需求。在教學(xué)內(nèi)容的優(yōu)化上，學(xué)生更注重研究進展的討論和熱點文獻的分析，教學(xué)內(nèi)容需要每年更新，不能一成不變。在教學(xué)方法改革中，試行討論式課堂的問題反應(yīng)在四個方面：個別小組成員因自制力不強、計算機水平限制、口頭表達能力欠缺等原因?qū)λx專題的基本理論或研究進展陳述不清楚，會一定程度上影響其他同學(xué)對該專題領(lǐng)域的學(xué)習(xí)。在課堂匯報環(huán)節(jié)，受部分同學(xué)表達能力的影響，學(xué)生的注意力不容易集中，課堂進展的節(jié)奏會略顯拖沓。在教學(xué)過程中容易出現(xiàn)兩極分化的現(xiàn)象，部分學(xué)生的主動性得到了很好的發(fā)揮，綜合能力得到了比較充分的鍛煉，也有個別學(xué)生在混學(xué)分，并沒有進行真正的自主學(xué)習(xí)。且教師對新的教學(xué)方法的理解和掌握的程度也一定程度上影響了學(xué)生的學(xué)習(xí)效果。在評價體系中，給學(xué)生公正、全面、合理的評價影響著學(xué)生的學(xué)習(xí)態(tài)度和熱情，但其過程是相當煩瑣的，需要教師團隊比較多的精力投入，適當?shù)募顧C制能更好地配合教學(xué)改革的推進。
三、展望
采用MTT法繪制細胞生長曲線。取第7代近融合的腸上皮細胞,消化后調(diào)整細胞密度為1×105/mL的單細胞懸液,接種于96孔板中,每孔接種100μL,接種15板,每3d更換一次細胞培養(yǎng)液。每天于相同時間取出一板細胞,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,培養(yǎng)4h后,吸出孔內(nèi)上清,每孔加入二甲基亞砜150μL,震蕩10min后于酶聯(lián)免疫檢測儀以490nm波長測吸收值。共測定15d,以時間作為橫坐標,光吸收值(D)作為縱坐標,繪制細胞生長曲線。1.8流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)分析細胞周期常規(guī)方法收集第7代近融合的腸上皮細胞,PBS洗滌2次,在離心管中留約0.5mL的PBS,向細胞懸液中緩慢加入75%冰乙醇,–20°C固定過夜。檢測前,1000r/min離心3min去除乙醇,PBS清洗1次,加入適量碘化丙啶染液(0.1%TritionX-100,10μg/mL碘化丙啶,50μg/mLRNase),室溫避光染色30min,上機檢測,計數(shù)10000個細胞,用MuticycleAV軟件進行DNA細胞周期擬合分析。增殖指數(shù)(proliferativeindex,PI)指增殖細胞占總周期細胞的比例,S期細胞指數(shù)(S-phasefraction,SPF)指細胞周期中處于S期細胞所占的比例。采用PI和SPF分析細胞的增殖活性,PI(%)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)×100%,SPF(%)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。1.9染色體核型分析參考已報道的方法[13],稍作修改。傳代細胞以1×105/mL的密度接種至96孔板。48h后換液,給予濃度為2μg/mL秋水仙素處理3h;消化收集細胞,37°C低滲(0.075mol/LKCl)處理20min;用新鮮配制(4°C預(yù)冷)的卡諾固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)預(yù)固定20min,離心去除上清,再視細胞量加入新鮮固定液0.5~1mL,以移液槍重懸沉淀;取出–20°C預(yù)冷的玻片,30cm高度滴片;空氣干燥,吉姆薩工作液染色10min,脫色,在顯微鏡下選擇分散良好,形態(tài)清晰的染色體中期分裂相,進行拍照,用Photoshop軟件進行染色體核型分析。
2結(jié)果
2.1IEC-P.A.的細胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)
用嗜熱菌蛋白酶和I型膠原酶聯(lián)合消化參環(huán)毛蚓腸組織,獲得的大量隱窩單位和散在細胞。隱窩單位培養(yǎng)48h即能貼壁,72h開始輻射出零星細胞;而散在的腸上皮細胞貼壁所需時間較長,接種一周才可形成少量的細胞集落(圖1A),15d開始貼壁,但附著不穩(wěn)定,稍振動即浮起。約28~30d細胞生長至85%~90%匯合,可進行傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)時有較多的細胞碎片,且上皮細胞與成纖維細胞夾雜生長,傳至第3代以后,細胞碎片明顯減少,類圓形上皮細胞數(shù)量增多,形態(tài)較一致。傳代后細胞生長穩(wěn)定,培養(yǎng)13~15d可見腸上皮細胞匯合成細胞單層,呈典型“鋪路石樣”鑲嵌排列,邊界清晰,互不重疊(圖1B)。透射電鏡下觀察培養(yǎng)的腸上皮細胞,可見細胞結(jié)構(gòu)完整,直徑為8±2μm,具有典型的腸上皮隱窩細胞特征。微絨毛從細胞表面伸出,排列整齊(圖2A),近絨毛端胞質(zhì)中分布豐富的線粒體,其嵴清晰可見(圖2B),細胞核周區(qū)域有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖2C)。
2.2IEC-P.A.的生長曲線
第7代參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的生長曲線見圖3,體外培養(yǎng)的腸上皮細胞存在著明顯的潛伏期,接種培養(yǎng)7~9d后才能進入對數(shù)生長期,經(jīng)過大約4d的對數(shù)生長期后,至13~15d開始進入平臺期,且能相對較長時間維持在這一時期。
2.3FCM分析IEC-P.A.細胞周期
參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的細胞周期檢測結(jié)果見圖4,細胞各個時期的分布狀態(tài)是G0/G1期為(93.13±0.12)%,S期為(3.73±0.23)%,G2/M期為(3.14±0.17)%,細胞的增殖活性指標PI為6.87%,SPF為3.73%。由此可見,體外培養(yǎng)的腸上皮細胞接種后,相對較長時間處于靜止期,尚未進行增殖分裂活動。
2.4IEC-P.A.染色體核型分析
本實驗所培養(yǎng)的腸上皮細胞來源于環(huán)節(jié)動物門的參環(huán)毛蚓,具有一定的特殊性,與常規(guī)哺乳動物的細胞差異較大。處于中期分裂相的腸上皮細胞所占比例較少,且處于分散狀態(tài)的染色體臂常常出現(xiàn)部分重疊(圖5A),但尚可應(yīng)用Photoshop軟件進行核型分析。根據(jù)所拍攝的20個細胞的中期分裂相,可以得出,參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的染色體數(shù)為2n=22,其中第1、2、5、8、9、11號染色體為中部著絲粒染色體,第4、7、10號染色體為亞中部著絲粒染色體,第3、6號染色體為亞端部著絲粒染色體,其染色體核型可表示為n()=x=6m+3sm+2st(圖5、表1)。整體來說,第3代參環(huán)毛蚓腸上皮細胞染色體沒有異常表現(xiàn),基因組相對穩(wěn)定。
3討論
體外培養(yǎng)的腸上皮細胞對于研究營養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝機制、藥物作用以及各種致病因素作用下的生理病理改變具有重要意義,所取得的研究成果可以為人工養(yǎng)殖活動提供科學(xué)指導(dǎo),從而帶來巨大的經(jīng)濟效益[14]。目前,蚯蚓種屬腸上皮細胞培養(yǎng)與生物學(xué)特性研究尚未見報道。本研究采用混合酶消化法對參環(huán)毛蚓腸上皮細胞進行分離培養(yǎng),穩(wěn)定傳至第8代,并研究了細胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、生長曲線、細胞周期和染色體核型等生物學(xué)特性,成功獲得參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系(IEC-P.A.)。不僅豐富了環(huán)節(jié)動物門的細胞資源及相關(guān)生物學(xué)特性資料,而且所建立的細胞培養(yǎng)技術(shù)及生物學(xué)特性檢測方法可以為蚯蚓種屬細胞培養(yǎng)及研究提供參考。分離腸上皮細胞常用的消化酶包括胰蛋白酶、膠原酶、嗜熱菌蛋白酶及中性蛋白酶。由于來源動物不同,關(guān)于各種消化酶的分離效果有不同的報道,其中嗜熱菌蛋白酶分離腸上皮細胞可獲得大量的健全絨毛隱窩單位,且傳代后增殖能力比較穩(wěn)定[15-17]。本實驗參考上述條件,對消化酶進行了適當調(diào)整,篩選確定嗜熱菌蛋白酶和I型膠原酶的混合酶液較適合分離參環(huán)毛蚓的腸上皮細胞。所得細胞懸液可見大量腸上皮細胞特有的隱窩單位。細胞鑒定是腸上皮細胞培養(yǎng)過程中一個重要內(nèi)容。除了觀察形態(tài)特征外,常用的有堿性磷酸酶染色法、電鏡法及免疫熒光染色法[18]。由于堿性磷酸酶染色法影響因素復(fù)雜,陽性率低;又因親緣性的關(guān)系,參環(huán)毛蚓腸上皮細胞缺少特異性標記物,而無法使用免疫學(xué)鑒定,所以本研究選取了透射電鏡觀察參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)。細胞表面可見大量微絨毛,胞內(nèi)含有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),符合腸上皮細胞的特征。應(yīng)用流式細胞技術(shù),對核酸染料標記的DNA進行檢測,能夠得到細胞各個時期的分布狀態(tài),通過計算G0/G1、S、G2/M期的百分數(shù),可以進行細胞周期分析,了解細胞的增殖能力[19]。常規(guī)測定時多選用碘化丙啶染料對DNA染色,但本實驗中發(fā)現(xiàn)碘化丙啶不能對75%冰乙醇固定的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞的DNA進行染色。分析其原因可能是碘化丙啶無法進入?yún)h(huán)毛蚓的細胞內(nèi)所致。為此,本團隊通過添加不同濃度TritionX-100進行破膜,最終選取的染色液組分為0.1%TritionX-100、10μg/mL碘化丙啶、50μg/mLRNase,使FCM分析參環(huán)毛蚓IEC細胞周期的檢測得以順利進行。但結(jié)果中變異系數(shù)(coefficientofvariation,CV)值、細胞碎片含量(%Debris)較高,表明此破膜染色方法還有待于進一步優(yōu)化。S期細胞比率(SPF)和增殖指數(shù)(PI)均可以反映細胞群體的增殖狀態(tài)和DNA的合成速度,因此常用它們的大小來表示細胞增值活性的高低[20]。
細胞凋亡采用FITC-PI雙染色方法檢測。制備轉(zhuǎn)染后的GSCs細胞懸液，每管加入10μLFITC溶液，避光孵育30min后，每管加入10μLPI溶液，C6流氏細胞儀每管抽取10000個細胞進行分析。實驗重復(fù)6次。細胞遷移及侵襲能力采用Transwell小室方法檢測。制備轉(zhuǎn)染后的GSCs細胞懸液，以每孔100μL含51×10細胞數(shù)接種于Transwell小室的上室，下室加入500μL高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），48h后取出小室，PBS清洗上室內(nèi)的細胞，室溫晾干后4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3遍，至于吉姆薩染色液中染色30min，取出室溫晾干后，置于顯微鏡直接觀察拍照，隨機選取5個視野計數(shù)染色細胞個數(shù)。細胞侵襲能力檢測需在Transwell小室的上室內(nèi)預(yù)先鋪置基質(zhì)膠，置37℃、5%CO細胞培養(yǎng)箱中26h后備用，余步驟與細胞遷移實驗相同。實驗重復(fù)6次。統(tǒng)計分析用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。實驗數(shù)據(jù)用表示，兩組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗，<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。
2結(jié)果
2.1U87來源的GSCs的鑒定
如圖1A所示，U87細胞置于干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后形成細胞球，此細胞球同時表達Nestin（神經(jīng)干細胞標志物）及CD133（腫瘤干細胞標志物），在圖1B中，細胞球在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)2周后，細胞表達膠質(zhì)細胞活化的典型標志物GFAP，以及神經(jīng)元的典型標志物tubulinIII。以上結(jié)果說明在干細胞培養(yǎng)基形成的細胞球細胞為典型的膠質(zhì)瘤干細胞，具有神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤干細胞的特征，并且具有多向分化能力。
2.2在GSCs中，miR-144呈現(xiàn)低表達狀態(tài)
如圖2所示，Real-timePCR結(jié)果顯示，與non-GSCs相比，在GSCs中miR-144的表達明顯降低（<0.01），說明miR-144可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。
2.3轉(zhuǎn)染后，miR-144的表達
如圖3所示，在pre-miR-144組中，miR-144的表達顯著提高（<0.01），而在anti-miR-144組中，miR-144的表達顯著降低（<0.01）。
2.4過表達miR-144降低GSCs的細胞活力
如圖4所示，在pre-miR-144組中，GSCs的細胞活力顯著降低（<0.01），而在anti-miR-144組中，GSCs的細胞活力顯著提高（<0.01），但是在pre-NC組和anti-NC組中，GSCs的細胞活力與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
2.5過表達miR-144促進GSCs凋亡
如圖5所示，在pre-miR-144組中，GSCs的細胞凋亡率顯著增加至15.6%（<0.01），而在anti-miR-144組中，GSCs的細胞凋亡率顯著下降到3.6%（<0.01）。但是在對照組，pre-NC組和anti-NC組中細胞凋亡率分別為8.1%，7.9%和7.9%，三組間無統(tǒng)計學(xué)差異。
2.6過表達miR-144抑制GSCs的細胞遷移及侵襲
如圖6所示，在pre-miR-144組中，細胞的遷移能力顯著降低（<0.01），而在anti-miR-144組中，細胞的遷移能力顯著提高（<0.01）。但是在pre-NC組和anti-NC組中，細胞遷移能力與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。此外，在細胞的侵襲能力檢測中，我們得到了相似的結(jié)果。
2.7MiR-144靶基因的預(yù)測
如圖7所示，我們經(jīng)過查閱生物信息學(xué)預(yù)測軟件Targetscan、Pictar和RNAhybrid等，發(fā)現(xiàn)有眾多基因存在miR-144的結(jié)合位點，經(jīng)查閱文獻得知其中X染色體連鎖鋅指轉(zhuǎn)錄因子（ZFX）和酪氨酸激酶受體（TEK）與GSCs的發(fā)生展有著密切的關(guān)系。
3討論
