摘要：【目的】對已克隆的海島棉U3和U6啟動子進(jìn)行功能鑒定,為構(gòu)建棉花CRISPR/Cas9多位點(diǎn)基因編輯技術(shù)體系提供更多可用的U3和U6啟動子。【方法】分別構(gòu)建以GbU3-2P和GbU6-7P為啟動子驅(qū)動sgRNA,以抗旱負(fù)調(diào)控基因GGB為靶序列的CRISPR/Cas9基因編輯載體,然后在新海16的棉花葉片原生質(zhì)體中進(jìn)行功能鑒定。通過Polymerasechainreaction方法富集構(gòu)建好的CRISPR/Cas9基因編輯載體的核心片段,并利用PEG瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將核心片段轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中。提取轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體基因組DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突變情況并測序驗(yàn)證。最后繪制靶基因突變的頻率分布圖來計(jì)算該CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率和確認(rèn)突變的真實(shí)性。【結(jié)果】靶基因測序結(jié)果顯示靶標(biāo)位點(diǎn)序列突變的類型全部為堿基替換。【結(jié)論】以GbU3-2P和GbU6-7P為啟動子的CRISPR/Cas9基因編輯體系可以成功地定點(diǎn)編輯棉花GGB基因的序列,引起基因突變。