摘要：目的原核表達(dá)弓形蟲(chóng)TgPRF蛋白,制備多克隆抗體并評(píng)價(jià)其作為內(nèi)參抗體的可行性。方法以剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子cDNA為模板,PCR擴(kuò)增TgPRF編碼基因,克隆至pGEX-4T-1載體,轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)情況。利用GST標(biāo)簽親和層析法純化重組蛋白。以純化后蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔,制備抗TgPRF多克隆抗體。收集弓形蟲(chóng)RH株速殖子,以制備的多克隆抗體為一抗,Western blotting檢測(cè)抗體特異性及效價(jià)。收集ATc調(diào)控下不同時(shí)間點(diǎn)的弓形蟲(chóng)iKO-Ty-TgAPH蟲(chóng)株速殖子進(jìn)行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗體為一抗,檢測(cè)TgAPH和TgPRF表達(dá)量的變化。結(jié)果 SDS-PAGE顯示:TgPRF在誘導(dǎo)4 h后表達(dá)量趨于飽和,相對(duì)分子量為52 ku,且呈可溶性表達(dá)。弓形蟲(chóng)RH株速殖子總蛋白進(jìn)行的Western blotting顯示:抗TgPRF多克隆抗體可識(shí)別內(nèi)源性的TgPRF,且該多克隆抗體稀釋至1∶10 000時(shí)仍可見(jiàn)明顯條帶;iKO-Ty-TgAPH蟲(chóng)株速殖子總蛋白進(jìn)行的Western blotting顯示:TgAPH的表達(dá)量隨ATc作用時(shí)間的增加呈遞減趨勢(shì),而TgPRF表達(dá)量基本維持恒定。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)制備的抗TgPRF多克隆抗體特異性和效價(jià)良好,可作為衡量弓形蟲(chóng)特定蛋白表達(dá)量的內(nèi)參抗體,也可直接檢測(cè)內(nèi)源性TgPRF的表達(dá)。